阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease, AD)是一种常见的神经退行性疾病。由于人口老龄化, 每年患老年痴呆症的人数在不断增加[1]。老年斑和神经纤维缠结是阿尔茨海默症的两个病理学特征[1-3]。老年斑的形成和β-淀粉样(Amyloid beta, Aβ)的聚集有关。Aβ通过单向横跨膜的淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)分解产生, 是一个含38~43个残基的蛋白, 它们表现出不同的聚集性质。毒害神经的Aβ聚集体是AD病理学的关键和中心步骤[3-5]。作为Aβ聚集的最终产物, Aβ纤维引起了广泛的研究。
Aβ42是由淀粉样前体蛋白APP分解产生, 含42个残基的β-淀粉样蛋白。通常将Aβ42纤维分成4个片段[6], 包括NT(前16号残基); β1区域(17—26号残基); Turn区域(27—30号残基)和β2区域(31—42号残基)。在中性条件下, Aβ42纤维有6个负电残基-Asp1, Glu3, Asp7, Glu11, Glu22, Asp23和3个正电残基-Arg5, Lys16, Lys28[7]。由于带电残基的pKa值不同, 纤维在不同pH下的静电荷不同。以His6(pKa~ 6.6)为例, 当pH < 6.6时, His6会质子化从而带1个正电, 而当pH>6.6时, His6不会质子化从而不带电。因此, 不同pH下Aβ42纤维的静电相互作用不同, 结构和形态学也会有所不同。
先前的研究已经就酸性对Aβ42的聚集、形态学等的影响取得了一定的研究成果[8]。例如, 不同pH下, 带电残基对之间不同的静电相互作用会产生不同大小的Aβ42低聚物, 以及对应的不同的低聚物分布[9]。Su Y和Chang P T[8]发现, 与中性条件下相比, Aβ42肽段在pH 5.8下聚集速度更快, 聚集形成的纤维更大更复杂。而且只有pH 5.8下聚集形成的纤维具有神经毒性。Tipping K W等[10]发现pH可以控制预成型的纤维的毒性。Shammas S L[11]等实验上发现胰岛素纤维在不同pH下有着不同程度的解离, 证明不同酸性下纤维的稳定性不同, 随pH的升高而降低。CryoEM密度图[12]揭示Aβ42纤维在不同pH下有着不同的形态学分布。然而, 原子层面上关于这些性质变化和pH之间的关系还没有被揭示。人们仍然不清楚为什么pH会导致纤维的这些变化。
因此, 本研究对纤维状的Aβ42三聚体和五聚体进行了分子动力学模拟。先前, 实验发现Aβ42单体倾向于聚集形成五聚体或六聚体[13]。因此, Aβ42五聚体是一个理想的研究模型。三聚体作为主要的毒性物种[14-16]和潜在的最小聚集种子[16], 也被选为本研究的一个模型。本研究选择接近生理条件的pH范围, 即pH 4.0~7.5进行研究。
1 建模和实验方法 1.1 模型构建本研究采用PDB ID:2BEG[17]来构建全长的Aβ42五聚体。用UCSF[18] Chimera软件补全前16号残基。Aβ42三聚体通过删掉补全的五聚体的2条链的方式获得。在pH 4.0~7.5的范围内, 本研究取了7个pH进行研究, 分别是4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。然后将蛋白结构上传到H++[19]网站来获取这7个pH下小纤维的质子化情况。对于三聚体, 因为它的质子化情况在pH 5.5、6.0和6.5下是相同的, 因此本研究用pH 6.5来代表这3个pH。
1.2 分子动力学模拟将蛋白放在含TIP3P水分子的盒子里, 小纤维和盒子边距设置为0.8 nm, 并加入Na+或Cl-中和蛋白所带的电荷。在能量最小化之后, 本研究先进行了一步淬火模拟[6], 这是为了让补得的前16号残基在空间分布上更为合理。淬火获得的结构作为分子动力学模拟的输入结构。模拟分两步:先在310 K下进行1 ns的限制的分子动力学模拟然后取消对蛋白的限制, 在310 K下进行30~300 ns[6]的分子动力学模拟。采用Gromacs 4.6[20]软件包, AMBER99SB-ILDN[21]力场。用PME[22]计算范得华力和长距静电力, cutoff值设置为1.2 nm。时间步长设置为0.002 ps。
2 结果和讨论 2.1 二级结构表 1是三聚体和五聚体在不同pH下的二级结构统计, 可以看出Aβ42三聚体和五聚体的二级结构随酸性的变化很小。对于小纤维, 它的β-sheet含量越高, 体系越稳定。三聚体的β-sheet含量在pH 7.5下最低(0.25), 在pH 5.0和7.0下最高(0.32)。而对于五聚体, 在pH 5.5下最低(0.33)而在pH 6.0下最高(0.40)。最大值和最小值之间的差值是0.07。另外, 三聚体和五聚体在所研究的pH条件下以及不同的pH下Helix的含量很低, 均不超过0.05, 说明小纤维结构的有序性。
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表 1 三聚体和五聚体在不同pH下的二级结构 Table 1 Secondary structure of trimer and pentamer under different pHs |
图 1和图 2为不同pH下三聚体和五聚体每条链的β-sheet含量。对于三聚体和五聚体而言, 最外层的链最容易受到溶剂的影响。三聚体只有1条链位于纤维结构中间, 保持完整, 而且在不同pH下它的β-sheet含量都是最多的。这和Ngo ST等[7]报道的截断的Aβ40三聚体2链的β-sheet含量要比1链和3链高一些相一致。此外, 在pH 4.0~6.5范围内, 三聚体1链的β-sheet含量多于3链, 而在pH 7.0~7.5范围内则刚好相反。对于五聚体, 除了pH 7.0之外, 其他pH下都是1链的β-sheet含量多于5链。此外, 三聚体和五聚体在不同pH下都是2链的β-sheet含量最高。从2链到5链β-sheet含量有一个逐渐递增的趋势, 证明纤维的扭转是从5链开始, 接着是4链、3链、2链。
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图 1 三聚体每条链的β-sheet含量 Figure 1 β-sheet content per chain of trimer |
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图 2 五聚体每条链的β-sheet含量 Figure 2 β-sheet content per chain of pentamer |
蛋白处于折叠状态还是非折叠状态取决于两个因素, 疏水性和静电荷[23]。改变蛋白带电残基所带电荷可以提高库仑相互作用并提高蛋白的稳定性, >1 kcal/mol[24]。通过变异体来提高β-turn的含量也有利于蛋白稳定性的提高[25]。关于纤维的生长机制, Luhrs T等[17]提出新添加的单体先结合原纤丝奇数端的疏水区(17~21号残基), 接着形成盐桥和氢键来稳定这种结合。β2-strand和模板之间的相互作用较β1要少一些, 因而它仍可能解离。接下来再加入的单体需要不断地去稳定新加上的单体。基于奇数端引发的纤维生长机制, Gurry T和Stultz C M的研究[26]则指出和β-core区域以氢键的形式结合形成的β-发夹结构对于Aβ40和Aβ42的生长是必须的, 纤维越长, 表面积越大, 因此他们提出低聚物的形成速率在有较大的纤维存在的情况下会更快。在中性条件下(pH 7.5), 三聚体1链尤其是β1区的β-sheet含量要明显少于五聚体。此外, 三聚体的扭转角要大于五聚体[27], 表明三聚体两个β strand会产生更大的变形, 不利于新加的Aβ单体和暴露的β1(CHC)区域相互作用。从这个角度来看, 本研究的结果支持Gurry T和Stultz C M的观点。然而, Han W和Schulten K[28]并不支持这种纤维生长机制, 他们提出在偶数端纤维的生长速度会更快一些, 因为偶数端纤维的β1区域暴露在溶剂中。之所以会有这两种矛盾的观点, 是因为他们的模拟都是基于长度有限的小纤维。纤维核中的原子数目是固定的, 从而奇数端和偶数端的β-sheet含量和表面积都是恒定的。事实上, 纤维越小, 在水溶液中的扭转就越厉害[29]。换句话说, 端处的表面积会随着纤维生长而逐步增加, 直到纤维增长到临界长度。到达临界长度的纤维的扭转角不再发生变化[30]。本研究的模拟结果显示1链的奇数端更有利于和新加的单体相互作用。
2.3 扭转角Aβ42纤维的β-螺旋结构会发生变形形成转角, 从而影响纤维结构的硬度及稳定性[6]。因此本研究计算了不同酸度下三聚体和五聚体的扭转角(θ), 如图 3、图 4所示。
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图 3 扭转角测量示意图 Figure 3 scheme of twist angles |
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图 4 三聚体和五聚体在不同酸度下的扭转角θ Figure 4 The twist angle of trimer and pentamerunder different pHs |
三聚体和五聚体在等电点(pH 5.0)处的扭转角最小, 因为在该pH下小纤维的静电荷最少, 具有最小的亲水性和最少的静电相互作用。而当pH < pI时, 小纤维静电荷为正, 从图 4可以看出, 三聚体和五聚体的扭转角在pH由5.0降到4.0的时候陡然上升。对于pH> pI(5.0), 小纤维带负电, 从图 4近似可以看出随着pH的升高, 三聚体和五聚体的扭转角呈下降趋势。由此可见, 蛋白静电荷为正时对其扭转角的影响更大。值得注意地是, 同三聚体相比, 五聚体的扭转角要明显小一些, 说明随着纤维的生长, 纤维的变形减少, 稳定性增加。
3 结论通过对Aβ42两个小纤维(三聚体和五聚体)在不同酸度下的分子动力学模拟和对二级结构, 每条链的β-sheet含量和扭转角的分析, 发现在pH 4.0~7.5范围内:三聚体和五聚体的二级结构尤其是β-sheet含量随pH的变化很小; 三聚体和五聚体每条链的β-sheet含量有所不同, 但大体上都是2链的β-sheet含量最高; 三聚体和五聚体的扭转角随pH变化有较大起伏, 受纤维的静电荷影响。三聚体和五聚体在等电点处扭转角最小, 且五聚体的扭转角要较三聚体小一些。小纤维的扭转以及生长都是由奇数端引起。
本研究初步讨论了关于纤维生长机制意见分歧的根源, 从而为后续对纤维的生长机制研究及药物的设计提供了新思路, 下一步将探究药物对小纤维的抑制作用, 从而进一步去验证小纤维的生长是否由奇数端引起。
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